Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
ЗОНАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФАЗЫ НОСИТЕЛЯ
Этот метод обычно используется лишь для небольших образцов испытуемых веществ.
Природа носителя, например, бумага, гель агара, ацетат целлюлозы, крахмал, агароза, полиакриламид, смешанный гель, служит причиной ряда дополнительных факторов, влияющих на подвижность:
- а) вследствие наличия каналов в фазе носителя, среднее растояние, которое проходит вещество, становится меньше реально пройденного расстояния;
- б) некоторые фазы носителя электрически не нейтральны. Поскольку носители являются неподвижной фазой, это иногда может приводить к значительно большему электроэндоосмотическому потоку;
- в) какое-нибудь нагревание в результате эффекта Джоуля может вызвать некоторое испарение жидкости с фазы носителя, что, в следствие капиллярности, приводит к движению раствора в направлении от краев к центру. Ионная сила в этом случае возрастает.
Следовательно, скорость передвижения зависит от таких главных факторов: подвижности заряженной частицы, потока скорости электроэндоосмоса и испарения жидкости с фазы носителя, а также силы (напряжения поля). Поэтому необходимо проводить испытание в строго определенных экспериментальных условиях и, по возможности, использовать стандартные вещества.
Прибор для электрофореза состоит из:
- источника постоянного тока, напряжение которого можно контролировать и, желательно, стабилизировать;
- электрофоретической камеры. Обычно это камера из стекла или твердой пластмассы, которая состоит из двух отдельных резервуаров - анодного и катодного, содержащих раствор электролита. В каждый резервуар камеры погружается электорд, напрмер, платиновый или графитовый. Они присоединяются изолированной схемой к соответствующему выходу источника питания и образуют анод и катод. Уровень жидкости в обоих резервуарах камеры поддерживается одинаковым для избежания переливания через сифон.
Электрофоретическая камера снабжена воздухонепроницаемой крышкой, которая поддерживает атмосферу насыщенной влажности на протяжении испытания и уменьшает испарение растворителя. При снятии крышки ток отключается предохранителем. Если электродвижущая сила измерена в интервале, превышающим 10 В, желательно охладить носитель;
- приспособления установки носителя:
Электрофорез на полосках. Полоски с носителем, поочередно смоченные электродным раствором, погружают в электродный резервуар, закрепляют и фиксируют соответствующим держателем для предупреждения диффузии электролита. Такими держателями можут быть горизонтальная рамка, направленный V-образный штатив или однородная поверхность с точками контакта через определенные интервалы.
Гель-электрофорез. Приспособление в основном состоит из стеклянной пластинки, на поверхность которой нанесен слой хорошо закрепленного геля одинаковой толщины. Соединение геля с электродным раствором осуществляется разными способами в зависимости от типа используемого прибора. Необходимо принять меры для предупреждения конденсации воды или высушивания твердого слоя;
- измерительного устройства или детектора.
Методика. Раствор электролита помещают в электродный резервуар. Соответствующим образом импрегнированный носитель с электролитным раствором помещают в камеру с обозначенными для используемого прибора условиями. Устанавливают линию старта и наносят образец. Подают электрический ток в течение определенного времени. После отключения тока носитель вынимают из камеры, высушивают и проявляют.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КОЛОНКАХ С ПОЛИАКРИЛАМИДНЫМ ГЕЛЕМ
При электрофорезе на колонках с полиакриламидным гелем стационарной фазой является гель, приготовленный из смеси акриламида и N,N'-метиленбисакриламида. Колонку с гелем готовят с использованием трубок длиной
7,5 см и внутренним диаметром 0,5 см.
Прибор. Состоит из двух вставленных вертикально один над одним резервуаров для буферного раствора, приготовленных из подходящего материала, например, поли(метил метакрилата). Каждый резервуар снабжен платиновым электродом. Электроды присоединены к источнику тока, что позволяет проводить испытание или при постоянном токе, или при постоянном напряжении. В основании верхнего резервуара имеется ряд держателей, равноудаленных от электрода.
Методика. Обычно растворы дегазируют до начала полимеризации и гели используют сразу после приготовления. Готовят предписанную смесь компонентов, заливают в соответствующие закрытые снизу стеклянные колонки до одинакового уровня около 1 см от верхнего края, избегая попадания пузырьков воздуха в колонки. На смесь геля наслаивают слой воды Р, чтобы исключить попадания воздуха, и оставляют для полимеризации. Гелеобразование обычно занимает около 30 минут и завершается, когда образуется четкое разделение поверхности геля и водного слоя. Водный слой удаляют. Нижний резервуар наполняют указанным буферным раствором. Колонки открывают и вставляют в держатели верхнего резервуара так, чтобы дно колонок было погружено в буферный раствор нижнего резервуара. Колонки осторожно наполняют указанным буферным раствором. Готовят испытуемые образцы и образцы сравнения, содержащие индикаторный краситель, и уплотняют путем растворения в них, например, сахарозы Р. Приготовленные образцы наслаивают на поверхность геля, используя для каждого образца отдельную колонку. Верхний резервуар наполняют тем же буферным раствором. Электроды подключают к источнику тока и проводят процесс электрофореза при указанных условиях: темературе, постоянном напряжении или токе. Источник тока отключают, когда индикаторный краситель почти переходит в нижний резервуар. Каждую колонку сразу вынимают из прибора и извлекают гель. Локализуют положение полос на электрофореграмме.
